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021-65232515
TB基因分型試劑盒HV-3說明書
TB Typing Kit HV-3
TB基因分型試劑盒HV-3說明書
目錄號:K2571
保存:2-8℃ 1 個月,-20℃保存一年
組分說明
應用 Cat. No. YJ2571-20 K2571-50
Kit Size 20 50
VNTR3820 400 μl 1 ml
高分辨3位點VNTR檢測 VNTR4120 400 μl 1 ml
VNTR3232 400 μl 1 ml
DNA 分子量標準 I MarkerⅠ 120 μl 300μl
DNA 分子量標準 II MarkerⅡ 100 μl 250μl
其它相關產品K2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9
產品簡介
本試劑盒是以分子流行病學最新研究進展1)為基礎,經工藝優(yōu)化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用結核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多態(tài)性進行基因型分型區(qū)分臨 床菌株,是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監(jiān)測結核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比,這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1,2,3),因此特別適合于中國用戶的需求。
通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優(yōu)化,使得本產品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比,本產品顯著提升了特異條帶信號強度,降低了使用粗制模板(煮沸菌液)時非特異條帶的出現(xiàn)率,使實驗操作更加簡便、快捷的同時,提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩(wěn)定性良好,能有效抵抗反復凍融(10次)和較長時間(一周)的室溫環(huán)境,更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。
本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9(貨號 YJ2570)的配套產品。對 VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本,如有必要,可使用本產品做更精細的進一步分型鑒定。本產品中的 3 個高分辨率檢測位點 VNTR3820,VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個檢測位點結合使用可將檢測的分辨率指數(shù)(Hunter-Gaston index,HGI)提升至 0.993 1)
參考文獻
1) Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium
tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)
2) Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping
Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)
3) Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype
strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.
注意事項
1. 本產品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9(貨號 YJ2570)的配套產品。待測菌株應先經過 VNTR-9 分型檢測,再使用 本產品檢測。且本產品的檢測結果應與 VNTR-9 的檢測結果進行整合分析。
2. 為避免污染,建議制備生物時與配制 PCR Mix 在不同的地點內進行,并使用不同的移液器。
3. 在樣本 DNA 的收集,抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應注意作好標記,同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。
4. 常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。
5. 每管 PCR Mix 中均含有不同的引物,不可混用??筛鶕?jù)實驗需求一次性分裝為不同的量,避免反復凍融。
6. 為避免打開反應管時,反應液飛濺,開蓋前請短暫離心,收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。
7. 吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix,建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。
8. 實驗前準備:1×TE 緩沖液(PH=8.0)、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、普通 PCR 儀、DNA 電泳設備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器:0.5-10 μl 和 20-200 μl。
操作步驟
1. DNA 模板制備:
1.1 從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本,重懸于 100 ul TE 中,80°C 滅活 30 分鐘。
1.2 滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作:
100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時注意避免 EP 管蓋子爆開,避免讓水進入管中),立即置于冰上 2 分鐘,12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘,取上清置于另一無菌 EP 管中,做上標記,-20°C 保存。
2 . 檢測程序:
2.1 取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3,待液體平衡到室溫后,輕微搖晃 3-4 次混勻,然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒,使蓋上的液體回落到管內。 2.2 三位點 VNTR 分型:對于 12 位點結果相同的菌株需進一步進行 VNTR 分型,即增加以下 4 個位點進行比較。
1)PCR 擴增:反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的 PCR Mix,加入 1 μl DNA 模板,混勻。
2)擴增條件:
a . VNTR3820:
步驟 溫度 時間
預變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 58℃ 30 s 30 個循環(huán)
延伸 72℃ 90 s
終延伸 72℃ 7 min
b. VNTR3232、VNTR4120:
步驟 溫度 時間
預變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 64℃ 30 s 30 個循環(huán)
延伸 72℃ 90 s
終延伸 72℃ 7 min
3)制膠、電泳:
a:注意事項:
重要!每次實驗需要設置陽性(H37Rv 菌株 DNA)和陰性對照(去離子水)。
關鍵!本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎來判讀 VNTR 位點基因型,因此,為了使結果準確,在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標準操作,應注意以下幾點:
a-1:制膠所用梳子為 18 孔。
a-2:凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形,影響結果判讀,舍棄不用,或者在其中一個孔點上陰性對照。剩余 16 孔分為 12 個樣本,3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1,2,M,3,4,5,
6, M,7,8,9,10,M,11,12,H37Rv",數(shù)字代表樣本,M 代表 DNA Marker。
a-3:PCR 擴增產物進行第—次電泳并使用 Marker I 時,凝膠濃度為 1%,電壓為 150V,時間為 100-120 分鐘。
a-4:如果擴增產物片段過大(>1000bp),需要再次電泳并使用 Marker II 時,凝膠濃度為 0.8%,電壓 150V,時間為150 分鐘。
b:制膠以及電泳過程:
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×12 cm 膠盤制膠,每塊膠為 80 ml。
b-1:稱取 0.8 g 瓊脂糖,加入 80 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖勻,觀察為均一透明溶液,無顆粒,再在天平稱量,補入適量的雙蒸水,以保持膠的濃度不受影響。
b-2:待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將溫熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。
b-3:待凝膠*凝結(室溫下放置 40 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,沒過膠面 1-2 mm。
b-4:上樣電泳:每塊膠中加入 12 個樣本(最邊上的孔不加樣),每個孔中加入 3-5 μl PCR 產物,同時每塊膠上加三個 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V,電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點最終讀數(shù)是否準確的關鍵,需要統(tǒng)一按照此標準操作。
b-5:部分位點在臨床菌株中存在擴增產物大于 1000 bp 的情況,對這些擴增產物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳,同時加入 DNA Marker II 作為條帶大小對照,電壓 150V,電泳時間 150 分鐘。
4)結果顯示:
MarkerⅠ
MarkerⅡ
5)結果分析:
a. 如果不同菌株的 3 個高變位點基因型也相同,可確定為成簇菌株;
b. 如果高變位點讀數(shù)高度相似,即只有 1-2 個高變位點有差別,需結合流行病學數(shù)據(jù)鑒定是否為成簇菌株;
c. 如果 3 個高變位點基因型都不一致,鑒定為單一菌株。
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